Suplement LVIII
Kosmos t. 33, 1984, s. 21-27
KRZYSZTOF BIENIARZ, PIOTR EPLER
Katedra Ichtiobiologii i Rybactwa Akademii Rolniczej
Kraków
ZMIANY PŁCI U RYB
Przed omówieniem zagadnienia zmian i kontrolowania płci u ryb konieczne jest chociaż bardzo pobieżne przypomnienie anatomiczno-genetycznych cech związanych z płcią.
U ryb właściwych Teleostei w przeciwieństwie do ryb spodoustych i pozostałych kręgowców jajniki, jądra i drogi wyprowadzające produkty płciowe rozwijają się z tego samego zawiązku. Drogi wyprowadzające dojrzałe komórki płciowe u Teleostei powstają niezależnie od układu moczowego. U ryb właściwych występują gatunki: — hermafrodytyczne (hermafrodytyzm synchroniczny, hermafrodytyzm następczy: protoandralny i protogynalny), — rozdzielnopłciowe (gonochoryzm niezróżnicowany i gonochoryzm zróżnicowany), — jednopłciowe — tylko samice rozmnażające się gynogenetycznie.
U większości ryb właściwych samce są heterogametyczne (XY) a samice homogametyczne (XX). U niektórych gatunków, jak np. u węgorza, jest odwrotnie. Samce są homogametyczne (ZZ), a samice są heterogametyczne (ZW).
Powyższe zagadnienia były obszerniej omawiane w artykułach drukowanych we „Wszechświecie” (Epler, Bieniarz 1979, 1981).
Pierwsze badania nad kontrolowaniem płci u ryb łososiowatych były rozpoczęte przez Padoa (1937, 1939). W badaniach tych zanurzano młodociane stadia pstrąga tęczowego w estronie. W rezultacie otrzymywano w potomstwie znacznie większy procent samic niż samców. Ponieważ jednak estron wywierał zdecydowanie ujemny wpływ i powodował duży procent śmiertelności, nie wykluczone, że większy procent samic był spowodowany większą śmiertelnością samców.
W roku 1973 Okada przeprowadził doświadczenia, w których świeżo wylęgłe larwy pstrąga tęczowego karmione były paszą z dodatkiem estronu. Na 1 kg paszy dawano 10, 50, 100 mg estronu. W grupie, w której osobniki otrzymywały w stwierdzono 79-94% samic, natomiast w grupie kontrolnej było 57,5% samic. W grupie która otrzymywała w paszy estron, nie było normalnych samców, a obserwowano stosunkowo duży procent ryb z niezróżnicowanymi gonadami.
Podobne doświadczenia przeprowadził Jalabert i wsp. (1975). W doświadczeniu tym pstrągi tęczowe trzymano w temperaturze 6-8°C i karmiono paszą z dodatkiem estronu. Zastosowano kilka dawek estronu na 1 kg paszy. Ryby zaczęto karmić dopiero 1 miesiąc po wylęgu do 5 miesiąca po wylęgu. Badano procent samców i samic po 2 latach od momentu wylęgu. Stwierdzono w potomstwie 54% samic, 10% samców, 30,5% osobników hermafrodytycznych i prawie 6% ryb sterylnych. Liczne osobniki hermafrodytyczne zawierały elementy dojrzałej tkanki jajnikowej i tkanki jąder tak, że można było dokonać samozapłodnienia.
Simpson (1975, 1976) i Simpson i wsp. (1976) przeprowadził doświadczenia z łososiem atlantyckim i pstrągiem tęczowym, zanurzając świeżo wylęgłe larwy na 2 godz. do roztworu zawierającego 250 µg estradiolu w 1 l, a następnie karmiąc larwy paszą zawierającą 20 mg estradiolu w 1 kg przez 120 dni. Histologiczne badanie gonad 16 miesięcy później wykazało, że 21 osobników, które przeżyły, były wyłącznie samicami. W innych badaniach przeprowadzonych w warunkach wylęgarni komercjalnej stwierdzono 100% samic w grupie pstrągów tęczowych, które otrzymywały w pożywieniu 20 mg estradiolu na 1 kg paszy przez 30 dni, przy czym rezultat był taki sam, jeżeli zamiast podania estradiolu w paszy zanurzano co jakiś czas larwy w kąpieli zawierającej ten hormon.
W innych doświadczeniach przeprowadzonych w laboratorium nie stwierdzono takiego wysokiego procentu samic w grupie pstrągów tęczowych, które były karmione paszą z dodatkiem estradiolu. Być może było to wynikiem różnicy między warunkami laboratoryjnymi a warunkami wylęgarni, zwłaszcza jeśli chodzi o zagęszczenie i fotoperiod.
W okresie karmienia ryb paszą z dodatkiem estronu lub estradiolu obserwowano zahamowanie tempa wzrostu, ale potem, kiedy przerwano podawanie do paszy estradiolu, różnice we wzroście między grupą doświadczalną a kontrolną zatarły się.
W ostatnich badaniach Van Den Hurk i wsp. (1980) otrzymał pewną feminizacją pstrąga tęczowego trzymając wylęg w 12°C i w N,N-dimethylformamidzie (0.1 ml/l wody akwaryjnej) i z 30 mg/l progesteronu przez 4 tygodnie po wylęgu.
W licznych innych doświadczeniach, m.in. przeprowadzonych przez Donaldsona i wsp. (1982), traktowano wylęg ryb łososiowatych metyltestosteronem. Stwierdzono, że metyltestosteron w odpowiednich dawkach powoduje, że genotypowe samice rozwijają się jako samce. Pozyskane od tych samców mleczko zawierało plemniki homogametyczne, które użyte do zapłodnienia jej normalnych samic dawały w efekcie w potomstwie 100% samic.
Stosowanie dużych dawek metyltestosteronu prowadziło do sterylizacji. I tak stwierdzono, że np. chów pstrąga tęczowego przez 4 — 8 tygodni od wylęgu w wodzie zawierającej 30 lub 300 µg metyltestosteronu na 1 1 powoduje sterylność, ale równocześnie bardzo wysoką (65%) śmiertelność. Podobne prace robiono z łososiami Oceanu Spokojnego, gdzie wysokie dawki metyltestosteronu prowadziły do sterylizacji ryb, a niskie powodowały przejście genotypowych samic w fenotypowe samce produkujące „samicze mleczko”. Jeżeli takie mleczko użyto do zapłodnienia normalnych jaj, to w potomstwie uzyskiwano 100% samic. Jeżeli do zapłodnienia normalnych jaj używano mleczka fenotypowych samców (wśród których były zarówno genotypowe samce, jak i genotypowe samice), to w potomstwie uzyskiwano 75% samic i 25% samców. Taki stosunek samic do samców mą duże znaczenie przy tzw. pasterstwie morskim (Donaldson i wsp. 1982).
Wiele badań przeprowadzono nad produkcją potomstwa składającego się wyłącznie z samic poprzez sztuczną gynogenezę. Pierwsze badania nad sztuczną gynogenezą przeprowadził Hertwig w 1911 r., używając jaj płazów, które pobudzał do rozwoju przez zaplemnienie ich inaktywowaną przez promienie gamma spermą (dawka promieniowania była tak dobrana, że powodowała tylko uszkodzenie materiału genetycznego, nie uszkadzając aparatu ruchu plemników). Dzięki temu plemniki mogły wnikać do jaja, ale nie mogły dokonać jego zapłodnienia.
Podobne prace były wykonywane na pstrągu potokowym Salmo trutta przez Oppermanna w 1913 r., a na karpiu przez Golovinską w 1969 r. i przez Nagy w 1978 r. We wszystkich tych wypadkach jaja były zaplemnione nasieniem, które było inaktywowane promieniami X. Natomiast jaja po zapłodnieniu były poddawane szokowi, najczęściej termicznemu.
Przy gynogenezie stosowano, jak wyżej wspomniano, szoki termiczne zimne lub gorące, co znacznie zwiększało procent diploidalnych jaj. Najlepsze rezultaty u ryb łososiowatych uzyskiwano przy stosowaniu zimnego szoku —0,4°C, który rozpoczynał się w 1 godz. po dodaniu wody do ikry i kontynuowany był przez prawie 7 godz. Gorący szok dawał dobre rezultaty, gdy stosowano temperaturę 27 — 29°C przez 10 min. natychmiast po zapłodnieniu lub zaczynając 30 — 50 min. od momentu zapłodnienia. Szok termiczny powodował wzrost diploidalnych jaj do 33%. Tego rodzaju doświadczenia przeprowadzili u Oncorhynchus kisutsch Refstie i wsp. (1981). Stwierdzono po 8 miesiącach, że w potomstwie tak otrzymanym było 100% samic. Po poddaniu takich samic androgenizacji otrzymano mleczko, które użyto do zapłodnienia jaj od samic gynogenetycznych różnego genetycznego pochodzenia. W efekcie uzyskano taki efekt, jaki się otrzymuje przy skrzyżowaniu oddzielnych imbredowych linii. Należy pamiętać, że inaczej działają wysokie temperatury, inaczej niskie. Wysokie temperatury powodują rozpuszczenie włókienek wrzeciona, a niskie temperatury zahamowanie cytokinezy. Różne gatunki ryb są różnie podatne na czynniki zewnętrzne, takie jak szok temperaturowy (zimny lub gorący), wysokie ciśnienie hydrostatyczne itp. wywołujące zahamowanie wyżej wymienionych procesów i sztuczną diploidyzację jaj. Bardzo łatwo np. wywołać diploidyzację jaj u Zebra fish, trudno u białego amura.
Stopień imbridingu utrzymywany przy gynogenezie zależy od tego, w jakim momencie proces mejozy został zahamowany. Mianowicie jeżeli została zahamowana 1 mejoza, to procent imbridingu wynosi 50, tzn. tyle, ile przy samozapłodnieniu, a gdy zahamowana jest druga mejoza, procent imbridingu waha się między 50—100%.
Stosując szok termiczny i normalne plemniki, uzyskano triploidalne samice i samce. Gonady samic posiadających 3 X były małe, z nienormalnym mejotycznym podziałem, natomiast jądra u samców były normalne (Chourrout). Rozwój jąder u samców trioploidalnych łososiowatych wiąże się z faktem, że zaczynają one mejozę dopiero na parę miesięcy przed okresem tarłowym.
Działając różnymi środkami chemicznymi można uzyskiwać triploidy. I tak zapłodnione jaja łososia atlantyckiego oraz zapłodnione jaja pstrąga tęczowego traktowano cytochalazinem B — 10 µg/ml w czasie 35 — 70 stopniogodzin. po zapłodnieniu do momentu stadium 4 komórek. Kariologiczne badanie po 4 dniach wykazało, że komórki embrionów były w większości tetraploidalne. Zanurzenie zapłodnionych jaj pstrąga źródlanego w 0,01% roztworze kolchicyny od 84 lub 90 stopniogodzin do 120 stopniogodzin od momentu zapłodnienia powodowało powstanie w komórkach poliploidalnej mozaiki (Refstie i wsp. 1977).
Najczęściej dla sprawdzenia poliploidalności mierzy się objętość jąder erytrocytów albo stosuje się metody cytogenetyczne w połączeniu z elektroforezą. Dobrze jest mieć genetyczny marker, np. wzór ubarwienia lub inną cechą morfologiczną. Diploidalny hybryd białego amura z pstrą tołpygą jest różny morfologicznie od triploidalnego hybrydu tych samych gatunków.
Triploidy tego samego gatunku morfologicznie są nierozróżnialne od diploidów tego samego gatunku. Dla uzyskania poliploidalności stosuje się szoki dla diploidyzacji jaj i normalne nasienie. Dla uzyskania hybrydów trioploidalnych używa się nasienia jednego gatunku ryby i jaj diploidalnych drugiego. Przeprowadzono takie krzyżówki białego amura z karpiem, pstrąga tęczowego ze źródlanym, białego amura z pstrą tołpygą. Poliploidalne hybrydy okazały się bardziej żywotne niż diploidalne hybrydy tych gatunków („normalne”), z tym, że u triploidów stwierdzono więcej cech matczynych, co można traktować jako marker genetyczny. Triploidy są sterylne i dlatego triploidyzację stosuje się u tych gatunków, w których pożądane jest zmniejszenie płodności. Stosuje się też inne metody dla sterylizacji. Często w celu sterylizacji ryb używano promieniowania. Zanurzenie łososi atlantyckich w wodzie ze strontem 90 powodowało depresję pierwotnych komórek płciowych i uzyskanie osobników sterylnych (Migalowskii 1971). Naświetlanie (kobalt 60) powodowało hamowanie rozwoju płciowego pstrąga tęczowego (Tashiro 1972). Ogólnie można powiedzieć, że promieniowanie może być użyte do sterylizacji łososiowatych, a specjalnie do opóźnienia dojrzewania. Do sterylizacji używa się też pewnych związków chemicznych, jak metallibure, który hamuje produkcję i uwalnianie gonadotropiny. Szczególnie dobrze działa na hamowanie dojrzewania u samców (Donaldson 1973, Flynn 1973).
Opisane powyżej sposoby manipulowania płcią mają na względzie zarówno aspekty teoretyczne, jak i praktyczne.
Aspektem teoretycznym jest poznanie genetycznych i anatomicznych podstaw „płciowości” i związanych z tym mechanizmów hormonalnych i socjalnych.
Aspekt praktyczny sprowadza się do następujących zagadnień. U wielu gatunków ryb (m.in. u Tilapii) chodzi hodowcom o ograniczenie płodności lub opóźnienie wieku, w jakim ryby osiągają dojrzałość płciową. Są to najczęściej gatunki wód subtropikalnych lub tropikalnych (np. Tilapia). Osiągają one szybko dojrzałość płciową przy małych rozmiarach i na dodatek trą się kilka razy do roku, co prowadzi szybko do przegęszczenia.
Szybkie osiąganie dojrzałości płciowej i kilkakrotne tarła w jednym roku prowadzą do zahamowania wzrostu, w rezultacie czego ryba konsumpcyjna jest bardzo mała, a jej wydajność rzeźna jest znikoma (zawiera dużo części niejadalnych). W celu wyeliminowania przedstawionych powyżej niekorzystnych zjawisk prowadzi się krzyżówki międzygatunkowe dla uzyskania niepłodnych mieszańców, oddziałuje się dużymi dawkami hormonów sterydowych na ryby w wieku, w którym następuje u nich różnicowanie się płci, aby spowodować sterylność, lub stosując mniejsze dawki sterydów usiłuje się produkować populacje jednopłciowe.
Populacje jednopłciowe wytwarza się również dla zwiększenia produkcji materiału zarybieniowego, natomiast sterylizację stosuje się obecnie celem przedłużenia przebywania w morzu populacji łososi Oceanu Spokojnego i zapewnienia w ten sposób dodatkowych przyrostów ryb w środowisku szczególnie bogatym w pokarm.
Z produkcją populacji sterylnych lub jednopłciowych łączy się także nadzieje na uzyskanie lepszego stosunku części jadalnych do niejadalnych, czyli poprawę tzw. wydajności rzeźnej. Badania teoretyczne nad sterowaniem płcią znalazły już praktyczne zastosowanie. A oto i przykłady. Na zjeździe w Wageningen (Holandia) Donaldson i wsp. (1982) przedstawili wyniki badań nad oddziaływaniem estradiolu lub testosteronu na ok. 40 tys. larw łososia pacyficznego. W wyniku działania estradiolu otrzymano populację składającą się wyłącznie z samic, a w wyniku działania dużych dawek testosteronu uzyskano populację ryb sterylnych.
Po tysiąc osobników z każdej grupy przeniesiono do sadz w morzu, aby kontrolować ich wzrost, śmiertelność i rozwój gonad. Pozostałe ryby poznakowano znaczkami przypiętymi do nozdrzy i pod płetwą grzbietową i wypuszczono do morza. Obie grupy miały podobną przeżywalność aż do momentu osiągnięcia przez grupę traktowaną estradiolem dojrzałości płciowej. Tempo wzrostu ryb sterylnych było wolniejsze niż ryb, które poddane były działaniom estradiolu, ale w przeciwieństwie do tych ostatnich kontynuowały wzrost w morzu po czasie, w którym samice osiągały dojrzałość płciową, przestawały rosnąć i wracały na tarło do rzeki (łososie Oceanu Spokojnego osiągają dojrzałość płciową raz w życiu i po tarle giną w większości wypadków).
Mięso ryb sterylnych okazało się jakościowo znacznie lepsze niż mięso dojrzałych samic. Na tym samym zjeździe Shelton (1982) przedstawił wyniki eksperymentu przeprowadzonego na skalę przemysłową z produkcją tylko samiczej populacji białego amura. W USA wiele zbiorników wodnych zarybiono amurem (Ctenopharyngodon idella) dla zabezpieczenia tych zbiorników przed nadmiernym zarastaniem. Niespodziewanie biały amur znalazł w wielu zbiornikach amerykańskich doskonałe warunki do rozrodu, co doprowadziło do nadmiernego wzrostu jego populacji. Biały amur zaczął niszczyć tarliska ryb fitofilnych, w tym tarliska cennej również punktu widzenia sportowego ryby, jaką jest sum amerykański. Spowodowało to podjęcie badań nad populacją jednopłciową (tylko samiczą) białego amura. Otrzymanie takiej populacji rozwiązał Shelton (1982) następująco: otrzymaną od dojrzałych samic ikrę zaplemniał inaktywowanym nasieniem nasieniem białego amura. W ten sposób rozwijały się tylko te jaja, które przypadkowo były diploidalne, gdyż znane jest zjawisko, że w większej liczbie jaj normalnych (haploidalnych) znajduje się nikły procent jaj diploidalnych. Shelton uzyskał dzięki temu na początku parę osobników które były gynogenetycznymi samicami. Część tych osobników w wieku 10-16 tygodni poddano działaniu testosteronu, wszczepiając im kapsułki zawierające ten steryd. Uzyskano w ten sposób genotypowe samice (samice białego amura są homogametyczne), które były fenotypowymi samcami produkującymi plemniki będące nosicielami wyłącznie chromosomów X. Używając takich samców do rozrodu z normalnymi samicami, uzyskiwano w potomstwie wyłącznie samice. Wyprodukowano już setki tycięcy takich ryb. Ponieważ w wielu krajach nie dopuszcza się na rynek mięsa zwierząt, które poddane były działaniu hormonów, stąd dużą przyszłość ma metoda przedstawiona przez Donaldsona (1982), polegająca na uzyskiwaniu populacji jednopłciowej samiczej przy użyciu wyłącznie androgenizacji. Dzięki temu uzyskuje się wśród normalnych samców również samce, które są genotypowymi samicami. Po sprawdzeniu przez analizę stosunku płci w potomstwie kilku samców, które pochodziły z populacji poddanej androgenizacji, wybiera się samce – genotypowe samice — i używa się je do tarła z normalnymi samicami. Uzyskuje się w potomstwie wyłącznie samice, które nigdy nie były poddane przez człowieka działaniu hormonów i mogą być dopuszczone do konsumpcji.
LITERATURA
[1] Chourrout D. – Thermal induction of diploid gynogenesis and triploidy in the eggs of the rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Reprod. Nurt. Dev. 20, 727—733, 1980.
[2] Donaldson E. M. – Reproducthe endocrinology of fishes. Am. Zool. 13, 909-927, 1973.
[3] Donaldson E. M., Hunter G. A. – Sex control in fish with particular reference to salmonids. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 39, 99-110, 1982.
[4] Epler P., Bieniarz K. – Rzadkie formy rozrodu i różnicowania się płci u ryb. Wszechświat 11, 258-260, 1979.
[5] Epler P., Bieniarz K. – Zapłodnienie ryb oraz rozwój jaj i larw. Wszechświat 2, 28-31. 1981.
[6] Flynn M. B. – The effect of methallibure and a constant 12 hours light: 12 hours dark photoperiod on the gonadal maturation of pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha). M. Sc. thesis. Dep. Zool. Univ. B. C. Vancouver, B. C. 70, 1973.
[7] Golovinskaya K.A. – Artificial gynogenesis in carp, 74-78. 1969. W: Cherfas B. I. [red.] Genetics, selection and hybridization of fish. Akad. Nauk SSSR, Transl. N.T.I.S., Springfield, VA.
[8] Hertwig O. – Die Radiumkrankheit tierischer Keimzellan. Arch. Mikrosk. Anat. Entwicklungsmech. 77, 1-97, 1911.
[9] Jalabert B., Billard R., Chevassus B. – Preliminary experiments on sex control in trout: production of sterile fishes and stimultaneous
self-fertilizable hermaphrodites. Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys. 15, 19-28, 1975.
[10] Migalovskii I. P. – Development of fish eggs and the early period of gametogenesis in the embryos and larvae of the Atlantic salmon under conditions of radioactive conditions of radioactive contamination of water. AEC transl. from Tr. Polyarn. Nauchno-Issled. 36, 52, 1971.
[11] Nagy A., Horvath L., Csanyi V. – Investigation on carp Cyprinus carpio L. gynogenesis. J. Fish. Biol. 13, 213-224, 1978.
[12] Okada H. – Studies on sex differentiation of salmonidae. I. Effects of estrone on sex differentiation of the rainbow trout (Salmo gairdneriii
irideus Gibbons). Sci. Rep. Hokkaido Fish. Hatch. 28, 11-21, 1973.
[13] Oppermann K. – Die Entwicklung von Forelleneiern nach Befruchtung mit radiumbestrahlten Samenfaden. Arch. Mikrosk. Anat. 83, 141-189, 1913.
[14] Padoa E. – Differenziazione e inversione (femminizzazione) di avanotti di Trota (Salmo irideus ) preventive trattati con ovone follicolare. Nota Monit. Zool. Hal. 48, 195-203, 1937.
[15] Padoa E. – Observations ultérieures sur la différenciation du sexe, norm le et modifiée par l’administration d’hormone follicularie, chez la triute (Salmo iridues). Bio-Morphosis I. 337-354, 1939.
[16] Refstie T., Stoss J., Donaldson E. M. – Production of all female coho salmon (Oncorhynchus kisutch) by diploid gynogenesis using irradiated sperm and cold shock. Aquaculture 29, 67-82, 1982.
[17] Refstie T., Vassvik V., Gjedrem T. – Induction of polyploidy in salmonids by cytochalasin B. Aquaculture 10, 65-79, 1977.
[18] Shelton W. L. – Production of reproductively limited grass carp for biological control of aquatic weeds – Phase II. Off. Water Res. and Tech. USDI, Water Resour. Res. Inst. Bull. 45, Auburn Univ. 1982.
[19] Simpson T. H. – Endocrine aspects of salmonid culture. Proc. R. Soc. Edinburgh (B) 17, 241-252, 1975-1976.
[20] Simpson T. H., Johnstone R.. Youngson A. F. – Sex reversal in salmonids. Int. Counc. Explor. Sea CM/E 48, 6, 1976.
[21] Tashiro F. – Effects of irradiation 60 Co gamma-ray on the maturation of rainbow trout. Bull. Jpn. Soc. Fish. 38, 793-797, 1972.
[22] Van den Hurk R., Slof G. A., Schurer F. A. – Gonadal sex differentiation in rainbow trout, Salmo gairdneri, with special reference to the effects of steroid hormones and N, N-dimethylfonnamide. Gen. Comp. Endocrinol. 40, 323, 1980.
Linki:
http://biuletyn.ur.krakow.pl/zasoby/19/biuletyn_1_81.pdf
http://www.eko.uj.edu.pl/~kozlo/pliki/Kosmos_ewolucja%20proporcji%20p%C5%82ci.pdf
http://pauza.krakow.pl/79_1_2010.pdf
http://dlibra.utp.edu.pl/dlibra/docmetadata?id=115&from=pubindex&dirids=8&lp=105
http://www.polskieradio.pl/23/266/Artykul/483862,Ryby-zmieniaja-plec