Suplement CLXXV

Ruczkal-Pietrzak E., 1977. Wpływ zanieczyszczenia środowiska wodnego olejem dieslowym na aktywność arylosuofataz i katepsyn w mięśniu szkieletowym karasia (Carassius carassius L.). [The influence of the pollution of the water environment by diesel oil on the arylosulphates and catepsyn activity in the skeleton muscle of the Crucian Carp (Carassius Carassius L.)]. Zeszyty Naukowe Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Gdańskiego – Oceanografia Nr 3 : 113-124.

 

Ewa Ruczkal-Pietrzak

WPŁYW ZANIECZYSZCZENIA ŚRODOWISKA WODNEGO
OLEJEM DIESLOWYM
NA AKTYWNOŚĆ ARYLOSUOFATAZ I KATEPSYN
W MIĘŚNIU SZKIELETOWYM KARASIA
(Carassius carassius L.)

Coraz bardziej wzrasta ilość substancji olejowych i zanieczyszczeń ropopochodnych znajdujących się w morzu. Jest to nierozerwanie związane z działalnością produkcyjną człowieka.

Wprowadzanie do środowiska czynników dotychczas nie występujących w nim w takim stopniu wywołuje różnorodne, najczęściej ujemne skutki. Prowadzi się usilne badania nad zmianami występującymi w środowisku wskutek naruszenia równowagi ekologicznej. Wpływ ropy naftowej i jej pochodnych na przeżywalność ryb, ich aktywność życiową, rozwój embrionalny, a także zmiany morfo- i histopatologiczne towarzyszące zatruciu był już badany.

Celem niniejszej pracy było ustalenie, czy istnieje zależność między przebywaniem ryb w środowisku zanieczyszczonym produktami naftowymi a aktywnością wybranych enzymów lizosomalnych, czy zmiany w aktywności enzymów są zależne od czasu przebywania ryb w zanieczyszczonym środowisku i od stężenia produktu naftowego w wodzie.

Materiał i metoda

Doświadczenia przeprowadzano na rybach z gatunku Carassius carassius L. — karaś pospolity. Złowiono je w lutym, w jeziorze na Wyspie Sobieszewskiej (koło Gdańska). Przechowywano je w dużym basenie napełnionym wodą wodociągową. Przed rozpoczęciem doświadczeń ryby przeszły kilkudniowy okres adaptacji do nowych warunków. Do doświadczeń brano zwierzęta obojga płci, z jednej klasy długości (7 — 9 cm). Jako produkt naftowy stosowano olej napędowy do silników wysokoprężnych, (tzw. olej dieslowy).

Podczas doświadczeń ryby trzymano w akwariach zawierających po 10 l. wody pobranej z tego baseny, w którym je uprzednio trzymano. Temperatura wody w akwariach wynosiła 14 — 15°C. Przewietrzania nie stosowano. W akwariach umieszczono po sześć osobników. Zwierząt nie karmiono. Po umieszczeniu zwierząt w akwarium do wody dodawano pipetą odpowiednie ilości oleju dieslowego.

W celu wybrania optymalnego czasu trwania doświadczenia, do pięciu akwariów zawierających po 6 osobników, dodano produktu naftowego w takiej ilości, by stężenie wyniosło 50 ppm. Po trzech, pięciu, siedmiu, dziewięciu i jedenastu dniach z kolejnych akwariów pobrano zwierzęta w celu oznaczenia aktywności arylosulfataz i katepsyn. Równolegle w sześciu akwariach prowadzono kontrolę. Woda w akwariach kontrolnych nie zawierała produktu naftowego. Oznaczenia wykazały, że najlepszym czasem trwania doświadczenia z punktu widzenia maksymalnych zmian w aktywności badanych enzymów jest okres siedmiu dni.

Dlatego doświadczenia, mające wykazać istnienie zależności między aktywnością arylosulfataz i katepsyn w mięśniu a stężeniem produktu naftowego w wodzie trwały po 7 dni każde.

Do akwarium dodano oleju dieslowego w takiej ilości, by stężenie w kolejnych akwariach wynosiło: 200 ppm, 100 ppm, 33 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 6,6 ppm, 5 ppm. Pozostałe warunki zachowano bez zmian.

Po zakończeniu ekspozycji w powyższych stężeniach karasie wyławiano z akwariów i zabijano przez obcięcie głowy. Natychmiast po zabiciu pobierano skrawek mięśnia. Z boku ciała usuwano łuskę. Skórę spłukiwano wodą destylowaną i osuszano ligniną. Skórę rozcinano na wysokości linii bocznej i zdzierano. Wycinano skrawek mięśnia grzbietowego z miejsca ponad linią boczną, z przodu cała. Skrawek mięśnia spłukiwano wodą redestylowaną i osuszano. Mięsień homogenizowano w 10-krotnej objętości 0,3 M roztworu sacharozy, w homogenizatorze MSE przy maksymalnych obrotach przez 5 min., w naczyniu chłodzonym lodem. Każdy fragment mięśnia homogenizowano oddzielnie. Homogenaty wirowano przez 3 minuty przy 3 tys. obrotów na minutę.

W każdym supernatancie oznaczano zawartość białka, aktywność arylosulfataz i katepsyn.

Zawartość białka oznaczano metodą Lowry (Lowry i in. 1951). Dla sporządzenia krzywej kalibracji posługiwano się roztworem wzorcowym albuminy wołowej.

Aktywność arylosulfataz oznaczano metodą Robinsona (Robinson i in. 1951), zmodyfikowaną przez Roy’a (Dogson i in. 1953 za Roy’em), używając jako substratu siarczanu nitrokatecholu firmy SIGMA.

Aktywność katepsyn oznaczano metodą Ansona (Anson 1938, Colowick, Kaplan 1955, Creach i in. 1969, Nilsson, Fange 1970). Z uwagi na fakt, że kwaśna aktywność proteolityczna tkanek wywołana jest głównie obecnością katepsyny D, substrat i pH dostosowano do optymalnych wymagań tej katepsyny. Jako substrat stosowano hemoglobinę wołową.

Przy pomiarach gęstości optycznej posługiwano się spektrolorytrem „Specol” z przystawką ZNV, firmy „Carl Zeiss Jena”.

Aktywność enzymów wyrażona w następujących jednostkach: aktywność arylosufataz w mµM 4-NC/mg białka, aktywność katepsyn w mµM tyrozyny/mg białka.

Wyniki opracowano statystycznie w oparciu o nieparametryczny test serii U (Ziomek 1965).

Wyniki

W każdej grupie oznaczono aktywność arylosulfataz i katepsyn w mięśniu sześciu osobników, następnie obliczono średnią (arytmetyczną) aktywność dla danej grupy i podano odchylenie standardowe.

Aktywność arylosulfataz w grupach kontrolnych nie wykazywała różnic statystycznie istotnych niezależnie od ilości dni ekspozycji. Podobnie aktywności katepsyn we wszystkich grupach kontrolnych nie różniły się statystycznie. Ekspozycja ryb w wodzie zanieczyszczonej produktem naftowym wywołuje wzrost aktywności arylosulfataz i katepsyn w ich mięśniu szkieletowym. Wzrost aktywności enzymów zależny jest od stężenia oleju dieslowego (przy jednakowym czasie ekspozycji) i od czasu przebywania ryb w zanieczyszczonej wodzie (przy jednakowym stężeniu).

Wyniki przedstawiające aktywność arylosulfataz i katepsyn podczas ekspozycji 3, 5, 7, 9 i 11-dniowej w stężeniu oleju 50 ppm oraz aktywność arylosulfataz i katepsyn po ekspozycji 7-dniowej w różnych stężeniach oleju przedstawiono kolejno na wykresach I, II, III, IV.

Aktywność arylosulfataz i katepsyn w mięśniu ryb eksponowanych w stężeniu produktu naftowego 50 ppm wzrasta istotnie w stosunku do grup kontrolnych już po 5 dniach ekspozycji. Najsilniejszy, bo ponad dwukrotny wzrost (średnio 135%) obserwujemy po 7 dniach; po 9 i 11 dniach wzrost aktywności kolejno 93 i 76%, co również stanowi różnicę statystycznie istotną. Wzrost aktywności katepsyn w mięśniu ryb eksponowanych w stężeniu 50 ppm jest procentowo jeszcze wyższy. Istotny statystycznie wzrost pojawia się po piątym dniu ekspozycji, po 7 dniach aktywność jest ponad trzykrotnie wyższa niż w grupie kontrolnej, po 9 i 11 dniach aktywność wzrasta kolejno о 143% i 138%.

Podczas ekspozycji siedmiodniowej najwyższe badane stężenia: 200 i 100 ppm nie spowodowały wzrostu aktywności arylosulfataz i katepsyn różniącego się w sposób istotny statystycznie od wartości kontrolnych.

Ekspozycja w niższych stężeniach produktu naftowego wywołuje silny wzrost aktywności obu enzymów, istotny statystycznie w porównaniu z wartościami kontrolnymi, (z tym że wzrost aktywności nie jest tak wysoki jak po ekspozycji 7-dniowej w stężeniu 50 ppm), przy czym w miarę obniżania stężenia produktu naftowego, aktywność enzymów spada, zbliżając się do wartości kontrolnych.

Katepsyny wykazują większą wrażliwość na obecność produktu naftowego w wodzie niż arylosulfatazy: podczas inkubacji w stężeniu 50 ppm po 7 dniach ekspozycji, aktywność katepsyn jest wyższa ponad trzykrotnie od wartości kontrolnej, aktywność arylosulfataz ponad dwukrotnie; po 9 i 11 dniach ekspozycji aktywność arylosulfataz zbliża się bardziej do wartości kontrolnej (różnica 93 i 76%) niż aktywność katepsyn (różnica 143 i 138%).

Rys. 1. Zależność między długością okresu ekspozycji w stężeniu oleju
dieslowego 50 ppm a aktywnością arylosulfataz
.— . — . — . AKTYWNOŚĆ W GRUPACH KONTROLNYCH
|- – – – -| ODCHYLENIE STANDARDOWE

Rys. 2. Zależność między długością okresu ekspozycji w stężeniu oleju
dieslowego 50 ppm a aktywnością katepsyn
— . — . — . AKTYWNOŚĆ W GRUPACH KONTROLNYCH
|- – – – -| ODCHYLENIE STANDARDOWE

Również podczas ekspozycji w stężeniach niższych aktywność katepsyn wolniej powraca do wartości kontrolnej niż arylosulfataz: wartość aktywności katepsyn wyższa od kontrolnej w sposób istotny statystycznie występuje po ekspozycji ryb w stężeniach: 33,3 ppm, 20 ppm, 13,3 ppm; podczas gdy istotne statystycznie podniesienie aktywności arylosulfataz występuje po ekspozycji ryb w stężeniach 33,3 i 20 ppm. Ekspozycje w stężeniach 13,3; 10; 6,6; 5 ppm nie powoduje już istotnego wzrostu aktywności arylosulfataz; ekspozycje w stężeniach 10; 6,6; 5 ppm — istotnego wzrostu aktywności katepsyn.

Dyskusja

Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że pod wpływem przebywania karasia w wodzie zmieszanej z olejem dieslowym wzrasta aktywność arylosulfataz i katepsyn w jego mięśniu szkieletowym, a zmiany te są zależne zarówno od stężenia produktu naftowego w wodzie, jak i od czasu ekspozycji ryb w zanieczyszczonym środowisku.

Postarano się porównać wpływ produktu naftowego na aktywność arylosulfataz i katepsyn z działaniem innych czynników na enzymy lizosomalne, ponieważ zestawienie z pracami na podobny temat jest niemożliwe z uwagi na brak odpowiednich danych w dostępnej literaturze. Wiadomo, że węglowodory pochodzenia naftowego gromadzą się w organizmach żywych. Zostało to m. in. stwierdzone po katastrofie tankowca „Florida” u wybrzeży amerykańskich, kiedy do wody wylało się ok. 700 000 l oleju dieslowego (40% węglowodorów aromatycznych).

Chromatografia gazowa wykazała obecność węglowodorów o identycznym składzie jak w wylanym oleju w osadach dennych na miejscu katastrofy, w ciele żywych ostryg (Crassostrea virginica) i w mięśniu przywodzącym przegrzebka (Aequipecten irradians). Węglowodory te pozostawały w wymienionych organizmach przez długi czas po katastrofie (ostatnie badania wykonano w kilka miesięcy po rozbiciu statku), przy czym zarówno skład węglowodorów jak i ich stężenie zmieniało się w czasie tylko nieznacznie. Usuwanie, względnie zużywanie węglowodorów przez organizm dotyczyło głównie węglowodorów o łańcuchu prostym, potem rozgałęzionym, natomiast bardziej toksyczne aromatyczne węglowodory podlegały tym procesom o wiele wolniej (Blumer, Souza, Sass 1970).

Wiadomo też, że węglowodory policykliczne gromadzą się w lizosomach (Allison 1967, 1969). Jako substancje szkodliwe dla organizmu mogą one pobudzać syntezę enzymów lizosomalnych, których ilość wzrastałaby wskutek wzmożenia procesów detoksykacji. Na przykład niektórzy autorzy zakładają, że aromatyczne węglowodory rakotwórcze ulegają w organizmie utlenieniu i sprzęganiu z kwasem glukuronowym, co prowadzi do ich detoksykacji. Podobną rolę mogłaby odgrywać arylosulfataza — sprzęgać węglowodory lub produkty ich utlenienia z resztami kwasu siarkowego (Drewa 1972). Niemożność strawienia węglowodorów mogłaby z jednej strony powodować z jednej strony rozpad niewydolnych lizosomów i uwalnianie enzymów, z drugiej zaś indukować powstawanie nowych lizosomów i syntezę nowych enzymów (Barret 1969, De Duve 1966).

Można by odpowiedzieć na pytanie, który z tych procesów zachodzi w wypadku omawianym w niniejszej pracy, gdyby połączyć oznaczanie wolniej i całkowitej aktywności enzymów z badaniami histochemicznymi. Niezależnie od tego czy w komórkach mięśnia szkieletowego wzrastała ilość lizosomów, czy istniejące lizosomy wskutek zwiększenia przepuszczalności błon uwalniały enzymy do cytoplazmy, któryś z tych procesów prowadził do podwyższenia aktywności arylosulfataz i katepsyn w homogenacie.

Brak wzrostu aktywności enzymów po inkubacji ryb w najwyższych stężeniach (200 i 100 ppm) produktu naftowego, przy jednoczesnym silnym wzroście aktywności po ekspozycji w stężeniu 50 ppm jest trudny do wytłumaczenia. Nie jest to jednak jedyny wypadek takiego działania: witamina A silniej wpływa na podniesienie poziomu aktywności lizosomalnych hydrolaz podawana w małych dawkach niż w dawkach toksycznych (Dingle 1969). Nie można oczywiście twierdzić, że produkty ropopochodne działają na błony lizosomalne analogicznie jak witamina A, jednakże nie są w swym działaniu na lizosomy zjawiskiem wyjątkowym.

Wzrost aktywności badanych enzymów podczas inkubacji ryb w produkcie naftowym (stężenie 50 ppm) między trzecim a siódmym dniem można prawdopodobnie wytłumaczyć stopniowym przenikaniem składników olejowych do organizmu, komórek i przez błony lizosomalne. Na siódmy dzień przypada prawdopodobnie maksymalnie reakcja lizosomów, będącą odpowiedzią na patologiczne wpływy środowiska. Później, po 9 i 11 dniach ekspozycja reakcja ta jest mniej gwałtowna. Sądzę, że istnieją dwie możliwości: albo następuje pewne wyrównanie równowagi w komórce, albo występują zakłócenia przeszkadzające wzmożonej syntezie enzymów.

Im niższe stężenie produktu naftowego w środowisku, tym słabsze działanie wywiera on na organizm, mniej węglowodorów przedostaje się do komórek i w związku z tym reakcja lizosomów jest coraz słabsza.

Wzrost aktywności nie jest prawdopodobnie spowodowany głodzeniem zwierząt, gdyż nie karmiono również zwierząt kontrolnych, poza tym ryby były głodzone wstępnie (przed użyciem ich do doświadczeń).

Niedotlenienie (hipoksja) jest czynnikiem labilizującym błony lizosomalne, a więc podwyższającym aktywność lizosomalnych hydrolaz w homogenacie. Ponieważ wiadomo, że produkty naftowe tworzą na powierzchni wody błonę utrudniającą natlenianie i warstwę pokrywającą ciało (w tym nabłonek skrzelowy), co przeszkadza zwierzętom w oddychaniu, więc można by uznać to za przyczynę wzrostu aktywności arylosulfataz i katepsyn w homogenacie w stosunku do kontroli, gdzie zjawisko zakłócania wymiany gazowej nie zachodziło wskutek braku produktu naftowego. Jednakże gdyby przyczyną główną była hipoksja to chyba prawidłowy byłby maksymalny wzrost aktywności enzymów po inkubacji ryb w najwyższym stężeniu produktu naftowego, kiedy zawartość tlenu była najniższa (nie stwierdzono, żeby małe niedotlenienie wpływało silniej na labilizację błon lizosomalnych niż duże, jest wprost przeciwnie). Poza tym, przypomnieć należy, że karaś należy do ryb wyjątkowo odpornych na niedotlenienie.

Zwiększona aktywność enzymów lizosomalnych wiąże się ze wzmożoną działalnością autofagiczną i autolityczną w komórce, a co za tym idzie — i w tkance. Nawet jeśli w omawianych tu przypadkach wzrost poziomu aktywności artylosulfataz i katepsyn nie wynikał z uwalniania ich w obręb cytoplazmy, lecz ze zwiększonej ilości całych, nieuszkodzonych lizosomów, to po śmierci zwierzęcia enzymy lizosomalne i tak są uwalniane.

Oznaczanie aktywności katepsyny D i beta-glukuronidazy podczas przechowywania mięsa wołowego wykazały, że w kilka dni po śmierci organizmu enzymy te są uwalniane z lizosomów i wzrasta ich wolna aktywność [Valin 1970]. Oczywiste jest, że wzrost wolnej aktywności katepsyny D — od której głównie zależy proteolityczna tkanek — nie jest czynnikiem wpływającym korzystnie na jakość mięsa rybiego podczas jego przechowywania, bo może dochodzić do autolitycznego trawienia białek.

LITERATURA

1. Allison A. C., Lysosomes and disease, „Scien. Am.”, 1967, 217/5, s. 62—73.

2. Allison A. C., Young M. R., Vital Staining and Fluorescence Microscopy of Lysosomes, W: Lysosomes in Biology and Pathology, Amsterdam 1969, s. 600—628.

3. Anson M. L., The Estimation of Pepsin, Trypsin, Papain and Cathepsin with Haemoglobin, „J. Gen. Physiol”, 1938, 221, s. 78—89.

4. Barret A. J., Properties of lysosomal Enzymes, (w:) Lysosomes in Biology ani Pathology, Amsterdam 1969, s. 245—312.

5. Blumer M., Couza G., Sass J., Hydrocarbon Pollution of Edible Shellfish by Oil Spili, „Mar. Biol.”, 1970, 5/3, s. 195—202.

6. Colowick S. P., Kaplan N. O., Methods in Enzymology, Vol. 2, New York 1955, Acad. Press.

7. Creach Y., Napoly L., Serfaty A., Variations de l’activité protéolytique des tissus de la carpe commune (Cyprinus carpiо L.) Pedant un jeûne prolongé, „Arch. SC. Physiol.”, 1969, 23, s. 351—364.

8. De Duve Ch., Wattlaux R., Functions of Lysosomes, „Ann. Rev. Physiol”., 1966, 28, s. 435—492.

9. Dingle J. T., The Extracelluar Secretion of Lysosomal Enzymes, (w:) Lysosomes in Biology and Pathology, Amsterdam 1969, s. 421—436.

10. Dogson K. S., Spenger B., Thomac J., Studies on Sulphatases, „Bioch. J.”, 1953, 53, s. 452—457.

11. Drewa G., 1972, Wpływ benzopyrenu i metylocholantrenu na aktywność niektórych enzymów lizosomalnych w skórze myszy białych „BN” i czarnych „C57BL” w początkowym okresie karcynogenezy, rozprawa doktorska, Gdańsk AM.

12. Lowry O. H. i wsp., Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, „J. Biol. Chem.”, 1951, 193, s. 265—275.

13. Nilsson A., Fange R., Digestive Proteases in the Cyclostome Myxine Glutionosa L., „Comp. Biochem. Physiol.”, 1970, 32/2, s. 237—250.

14. Robinson D., Smith J. N., William R. T., Colometric Determination of Arylosulphatase Activity, „Bioch. J.”, 1951, 49. LXXIV—LVXV.

15. Valin C., Activation of Lysosomal Enzymes in Beef Muscle during Aging of Meet, „Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys.”, 1970, 10/2, s. 313—316.

16. Ziomek M. J. i in., Statystyka, Sopot 1965, WSE.

E. Ruczkal-Pietrzak

THE EFFECT OF THE POLLUTING OF WATER BY DIESEL OIL, ON THE ACTIVITY OF
ARYLSULPHATASIS AND KATHEPSIN IN THE SKELETAL MUSCLE OF THE CRUCIAN CARP
(CARASSIUS CARASSIUS L.)

The effect of water polluted by diesel oil, on the activity of arylsulphatasis and kathepsin in Carassius carassius skeletal muscle was investigated.

A homogenized muscle used to determine the activity of arylsulphatasis — by the Robinson method (1951), kathepsin — by the Anson method (1938), the results being converted into mg. of protein.

Each experimental group of fish consisted of six individuals kept in 10-litre tanks without aeration and with the addition of a certain amount of diesel oil, or without diesel oil in the case of the control fish. The fish were kept for 3, 5, 7, 9 and 11 days in a concentration of 5 ppm, in order to determine the time needed for the maximum changes in enzyme activity to appear.

Beginning from the fifth day, greater activity was observed in both enzymes, in comparison with those of the control fish. The highest increase was noted after seven days — double for arylsulphatasis and treble for kathepsin. Further experiments during the seven-day period, concerned the effect of the concentration of diesel oil on the activity of both enzymes. Concentrations of: 200; 100; 33.3; 20; 13.3; 10; 6.6 and 5 ppm. were investigated. In the two highest concentrations, the arylsulphatasis and kathepsin activity was within the range of the control values.

A statistically important increase in the control value after being kept in concentrations of: 33.3 and 20 ppm. for arylosulphatasis and 33.3; 20 and 13.3 ppm. for kathepsin, but in neither case was there such a rapid increase in activity as in the 50 ppm. concentration in any other concentration.

Э. Ручкаль-Петжак

ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДНОЙ СРЕДЫ МАСЛОМ
НА АКТИВНОСТЬ АРИЛОСУЛЬФАТАЗОВ
И КАТЕПСИНОВ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ

Исследовано влияние водной среды загрзнённой дизельным маслом на активность арилосульфатазов и катепсинов в скелетной мышце Carassius carasius L. находящегося в этой среде.

Активность обозначено на гомогенате из мышцы методом Робинсона (Ribinson 1951) для арилосульфатазов, методом Ансона (Anson 1938) для катепсинов, и пересчитано на мг. белка. Каждая опытная группа рыб состояла из шести особей, находящихся в десятилитровых аквариумах, без проветривания воздухом, с добавкой соответственного количества дизельного масла или без масла для контрольных групп. Чтобы определить время, в которое выступают максимальные изменения в активности энзимов в концеентрации 50 ррт. рыбы продерживались 3, 5, 7, 9 и 11 дней. Начиная с пятого дня экспозиции появился рост активности обоих энзимов, чётко отличающийся от контрольных величин. Самый большой ,выше чем в два раза для арилосульфатазов и в три раза для катепсинов, рост наступил тосле семидневной экспозиции. Следующие семидневные опыты касались влияния концетрации дизельного масла на активность обоих энзимов. Прослежено концентрации 200; 100; 33,3; 20; 13,3; 10; 6,6 и 5 ррт. Для двух самых высоких концентраций активность энзимов содержалась в границах контрольных величин. Статистически рост контрольных величин наступил для арилосульфатазов при экспозиции в концентрации 33,3 и 20 ррт., для катепсинов при экспозиции в концентрации 33,3; 20 и 13,3 ррт., но для обоих случаев ни в какой другой концентрации не обнаружено так резкого роста активности, как в концентрации ррт.